Birus gehienen sekuentzia genomikoak ezagutu dira.Azido nukleikoko zundak, DNAren segmentu laburrak diren DNA birusal edo RNA segmentu osagarriekin hibridatzeko diseinatuta.Polimerasaren kate erreakzioa (PCR) birikoak detektatzeko teknika eraginkorragoa da.Errendimendu handiko diagnostiko metodoak garatu dira azkenaldian.
A. Azido nukleikoak hibridatzeko teknika
Azido nukleikoen hibridazioa, batez ere Southern blotting (Southern) eta Northern blotting (Northern) barne, azkar garatzen ari den teknika berri bat da birusen diagnostiko arloan.Hibridazio-saiaketaren arrazoia DNAren segmentu laburrak erabiltzea da («zunda» izenekoa) DNA birusal edo RNA segmentu osagarriekin hibridatzeko diseinatuta.Berotze edo tratamendu alkalinoaren bidez, kate bikoitzeko xedeko DNA edo RNA kate bakarrean bereizten dira eta ondoren euskarri solido batean inmobilizatu egiten dira.Horren ostean, zunda gehitzen da eta xede-DNA edo RNArekin hibridatzen da.Zunda isotopoarekin edo nuklido ez-erradiaktiboarekin markatuta dagoenez, xede-DNA edo RNA autoerradiografia bidez edo biotina-abidina sistemaren bidez detekta daiteke.Biriko genoma gehienak klonatu eta sekuentziatu direnez, birusen sekuentzia espezifikoak erabiliz detektatu daitezke alearen zunda gisa.Gaur egun, hibridazio metodoak honako hauek dira: dot blot , in situ hibridazioa zeluletan , DNA blotting (DNA) (Southern blot) eta RNA blotting (RNA) (Northern blot).
B.PCR Teknologia
Azken urteotan, in vitro azido nukleikoen anplifikazio-teknika batzuk garatu dira PCRan oinarrituta, birus sentikor edo landu ezinak probatzeko.PCR in vitro polimerasa erreakzioaren bidez DNA sekuentzia espezifikoak sintetiza ditzakeen metodo bat da.PCR prozesuak hiru pausoko ziklo termiko bat barne hartzen du: desnaturalizazioa, annealing eta luzapena Tenperatura altuan (93 ℃ ~ 95 ℃), kate bikoitzeko DNA bi DNA kate bakarrean banatzen da;ondoren, tenperatura baxuan (37 ℃ ~ 60 ℃), sintetizatutako bi nukleotido-abiarazle DNA-segmentu osagarrietara eraskatzen dira;aldiz, Taq entzimaren tenperatura egokian (72 ℃), DNA kate berrien sintesia hasierako 3'muturretik hasten da DNA osagarria txantiloi gisa eta nukleotido bakarrak material gisa erabiliz.Beraz, ziklo bakoitzaren ondoren, DNA kate bat bi katetan handitu daiteke.Prozesu hau errepikatuz, ziklo batean sintetizatutako DNA-kate bakoitza txantiloi gisa erabil daiteke hurrengo zikloan, eta DNA-kateen kopurua bikoiztu egiten da ziklo bakoitzean, hau da, PCR-aren ekoizpena 2n log-abiaduran handitzen da.25 eta 30 zikloren ondoren, PCRren ekoizpena elektroforesiaren bidez identifikatzen da eta DNAren produktu espezifikoak UV argiaren azpian beha daitezke (254 nm).Espezifikotasun, sentikortasun eta erosotasunaren abantailagatik, PCR infekzio biriko askoren diagnostiko klinikoan onartu da, hala nola HCV, GIB, CMV eta HPV.PCR oso sentikorra denez, birusaren DNA fg mailan detektatu dezake, eragiketa kontu handiz egin behar da positibo faltsuak ekiditeko.Gainera, azido nukleikoen probaren emaitza positiboak ez du esan nahi lagin infekzioso bizirik dagoenik.
PCR teknikaren aplikazio zabalarekin, PCR teknikan oinarritutako teknika eta metodo berriak garatzen dira proba helburu desberdinetarako.Adibidez, denbora errealeko PCR kuantitatiboak karga birikoa detektatu dezake;in situ PCR ehunetan edo zeluletan birusen infekzioa identifikatzeko erabiltzen da;Habiaratutako PCRak PCRren espezifikotasuna areagotu dezake.Horien artean, denbora errealeko PCR kuantitatiboa azkarrago garatu da.Teknika berri asko, hala nola, TaqMan hidrolisi-zunda, hibridazio-zunda eta baliza molekularreko zunda, denbora errealeko PCR teknika kuantitatiboan konbinatu dira, ikerketa klinikoan asko erabiltzen dena.Gaixoen gorputz-fluidoen karga birikoa zehaztasunez identifikatzeaz gain, metodo hau droga-tolerantzia mutantea detektatzeko ere erabil daiteke.Hori dela eta, denbora errealeko PCR kuantitatiboa efektu sendagarrien ebaluazioan eta droga-tolerantziaren zaintzan aplikatzen da batez ere.
C. Azido nukleiko biralen errendimendu handiko detekzioa
Gaixotasun infekzioso berrien diagnostiko azkarra egiteko beharrak asetzeko, errendimendu handiko detekzio-metodo desberdinak ezarri dira, hala nola DNA txipak (DNA).DNA txipetarako, zunda espezifikoak sintetizatzen dira eta oso dentsitate handiko siliziozko txip txikiei lotzen zaizkie, laginarekin hibridatu daitekeen DNA zunda mikroarray (DNA) osatzeko.Hibridazio-seinalea mikroskopio konfokalaren edo laser-eskaneraren bidez irudikatu daiteke eta ordenagailuak gehiago prozesatu eta gene desberdinei buruzko datu multzo handia lor daiteke.Bi DNA txip mota daude.“Sintesi txipa” honako hau da: oligonukleotido espezifikoak txipetan zuzenean sintetizatzen dira.Beste bat DNA igerilekuko txipa da.Klonatutako geneak edo PCR produktuak ordenatuta inprimatzen dira diapositiban.DNA txip teknologiaren abantaila DNA sekuentzia kopuru handi bat aldi berean detektatzea da.Patogenoak detektatzeko txiparen azken bertsioak 1700 giza birus baino gehiago identifikatu ditzake aldi berean.DNA txiparen teknologiak azido nukleikoen hibridazio metodo tradizionalen arazoak konpondu zituen eta oso aplikazio zabalak ditu diagnostiko birikoaren eta azterketa epidemiologikoan.
Argitalpenaren ordua: 2020-12-23